茶鲜叶中的挥发性代谢物质不仅对茶叶香气品质形成有着重要贡献浙商证券证交所，同时也参与茶树的生长调节、生物胁迫、非生物胁迫等过程。茶鲜叶的挥发性物质受茶树品种、生态环境、产地土壤条件、肥培管理和外源诱导等多种因素影响，近年来成为业内研究的热点。
在加工工艺研究中，固样方法的选择直接影响加工过程香气成分的变化规律；在茶树品种鉴定、鲜叶品质评价等研究中，合适的固样方法能够真实地反映茶品种特性和茶青质量，为品种选育和品质鉴定提供可靠依据。固样能够最大程度地保留样品原有的化学成分，是进行化学鉴定和后续研究的重要前提。目前，固样方法主要有热空气固样、微波固样、蒸汽固样、锅炒杀青固样、真空冷冻固样等。
茶叶中的挥发性物质含量低、组成复杂、易挥发、不稳定，提取过程中易发生氧化、聚合、基团转移等反应，不同的提取方法会使香气成分种类、含量产生较大差异。目前，普遍使用顶空固相微萃取（HS-SPME）对茶叶香气进行提取。气相色谱-质谱（GCMS）是近年来茶叶中挥发性化合物定性分析应用较多的一种检测方法。
贵州大学茶学院的杨显凤、贵州省茶叶研究所的张拓和张小琴*等采用HS-SPME-GC-MS技术对茶树品种‘黔茶1号’一芽二叶挥发性物质进行定性和定量测定，分析不同固样方式对‘黔茶1号’鲜叶挥发性物质成分类别和含量的影响，采用主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和层次聚类分析筛选关键挥发性成分，旨在探究不同固样方式下‘黔茶1号’鲜叶挥发性物质的差异，为茶鲜叶挥发性代谢物质调控、高香茶树资源鉴定等研究提供更完整的分析方法和理论基础。
01
不同固样处理对挥发性物质种类和含量的影响
将不同固样样品中鉴定出的挥发性物质分为6 类：醇类、酯类、醛类、烯烃类、酮类和其他类。如表1所示，挥发性物质总质量浓度大小排序为真空冷冻固样（112.93 mg/L）＞液氮固样（94.81 mg/L）＞蒸汽固样（31.21 mg/L）＞微波固样（29.60 mg/L）＞热风固样（29.42 mg/L），醇类质量浓度大小排序为真空冷冻固样（88.03 mg/L）＞液氮固样（58.67 mg/L）＞热风固样（11.58 mg/L）＞微波固样（11.12 mg/L）＞蒸汽固样（9.24 mg/L），酯类质量浓度大小排序为液氮固样（15.25 mg/L）＞真空冷冻固样（12.11 mg/L）＞蒸汽固样（3.43 mg/L）＞微波固样（2.18 mg/L）＞热风固样（1.57 mg/L）。液氮固样和真空冷冻固样组检测出的醇类、酯类和挥发性物质总量均显著高于热风固样、微波固样、蒸汽固样组（P＜0.05），真空冷冻和液氮2 种低温固样方式显著高于蒸汽固样、微波固样和热风固样3 种有热力作用参与的固样方式。醛类质量浓度大小排序为液氮固样（3.99 mg/L）＞真空冷冻固样（3.28 mg/L）＞蒸汽固样（2.86 mg/L）＞微波固样（1.90 mg/L）＞热风固样（1.73 mg/L），各组之间无显著差异；烯烃类物质仅真空冷冻固样（5.99 mg/L）显著低于其他4 种固样方式（P＜0.05）；酮类挥发性物质仅在真空冷冻固样、热风固样和蒸汽固样组中检测到，且三者之间无显著差异；蒸汽固样和真空冷冻固样组的其他类挥发性物质质量浓度显著高于其他3 组（P＜0.05）。由此可知，液氮固样能够保留住更多含量的酯类、醛类、烯烃类挥发性物质，真空冷冻固样能够保留住更多含量的醇类挥发性物质。在3 种热力固样方式中蒸汽固样能保留更多的酯类、醛类和其他挥发性物质，但仅在其他类达到显著水平。
如图1所示，真空冷冻固样（48 种）和液氮固样（47 种）组的挥发性物质数量明显高于蒸汽固样（38 种）、微波固样（38 种）、热风固样（37 种）组；液氮固样（17 种）和真空冷冻固样（17 种）组的醇类数量明显高于热风固样（13 种）、微波固样（13 种）、蒸汽固样（11 种）组；液氮固样组（11 种）的酯类数量明显高于真空冷冻固样（9 种）、微波固样（6 种）、蒸汽固样（7 种）、热风固样（4 种）组；真空冷冻固样（7 种）和液氮固样（6 种）组的醛类数量明显高于蒸汽固样（4 种）、微波固样（3 种）、热风固样（2 种）组；热风固样组（11 种）的烯烃类数量明显高于液氮固样（10 种）、微波固样（10 种）、真空冷冻固样（9 种）、蒸汽固样（8 种）组；热风固样组（2 种）的酮类数量明显高于真空冷冻固样（1 种）、蒸汽固样（1 种）组；蒸汽固样（7 种）和微波固样（6 种）组的其他类数量明显高于真空冷冻固样（5 种）、热风固样（5 种）、液氮固样（3 种）组。从挥发性物质数量来看，醇类数量在各组的占比较高，且各组间变化显著。未经热力处理的固样方式（真空冷冻、液氮）中醇类物质较多，而涉及热力作用的固样方式（蒸汽、微波、热风）中较少，这与胡云铃的研究结果一致。推测热力作用导致部分不稳定挥发性物质随水蒸气挥发，部分低含量物质降至检测限以下。液氮和真空冷冻固样因低温减少了挥发性物质的释放，保留了更多物质。
02
不同固样处理下‘黔茶1号’挥发性物质分析
由表2可知，5 种固样方式样品共分离鉴定出73 种挥发性化合物，包括醇类23 种、酯类14 种、醛类10 种、烯烃类15 种、酮类4 种和其他类7 种，其中有71 种在处理组间差异显著（P＜0.05）。具有似铃兰花香的芳樟醇，是醇类中质量浓度（1.43～50.52 mg/L）最高的挥发性物质，真空冷冻固样（50.52 mg/L）、液氮固样（44.60 mg/L）组的芳樟醇质量浓度显著高于蒸汽固样组（1.43 mg/L），而其他2 种固样方式未检出。液氮固样组的红没药醇（0.42 mg/L）、T-依兰油醇（1.57 mg/L）、Α-毕橙茄醇（1.18 mg/L）质量浓度都显著高于其他4 种固样方式，液氮固样组的橙花醇质量浓度（3.56 mg/L）显著高于热风固样、微波固样、蒸汽固样3 种高温固样方式，但与真空冷冻固样（2.37 mg/L）组无显著差异。真空冷冻固样组的氧化芳樟醇I（4.15 mg/L）、芳樟醇氧化物II（16.40 mg/L）、苯甲醇（0.76 mg/L）、苯乙醇（1.41 mg/L）质量浓度显著高于其他4 种固样方式；真空冷冻固样组的芳樟醇（50.52 mg/L）和橙花叔醇（2.04 mg/L）质量浓度显著高于热风固样、微波固样、蒸汽固样3 种高温固样方式，但与液氮固样的差异未达显著水平。
酯类中具有水果清香的己酸叶醇酯是其中质量浓度（0.53～4.35 mg/L）最高的挥发性物质，真空冷冻固样组的己酸叶醇酯质量浓度（4.35 mg/L）显著高于液氮固样（2.65 mg/L）和蒸汽固样（0.53 mg/L）组，而其他2 种固样方式未检出。液氮固样组的丙位十二内酯质量浓度（0.57 mg/L）显著高于真空冷冻固样组（0.44 mg/L），其他固样方式中未鉴定出。真空冷冻固样组的顺-3-己烯基丁酯（1.35 mg/L）、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯（0.33 mg/L）质量浓度显著高于其他4 种固样方式。蒸汽固样组的D-泛内酯（0.27 mg/L）、丙位壬内酯（0.60 mg/L）质量浓度显著高于其他4 种固样方式。
醛类中质量浓度最高的挥发性物质是反式-2-癸醛（0.89～1.42 mg/L），它具有类似柑橘的香气；液氮固样组的反式-2-癸醛质量浓度（1.42 mg/L）显著高于真空冷冻固样（0.89 mg/L）、热风固样（1.05 mg/L）、微波固样（1.08 mg/L）和蒸汽固样（1.10 mg/L）组。液氮固样组的正己醛质量浓度（0.21 mg/L）显著高于真空冷冻固样（0.06 mg/L），而其他固样方式中未鉴定出。蒸汽固样组的凤梨醛质量浓度（0.11 mg/L）显著高于微波固样组（0.03 mg/L），其他固样方式中未检出；蒸汽固样组的癸醛质量浓度（0.21 mg/L）显著高于液氮固样和热风固样组，但与真空冷冻固样、微波固样组无显著差异。
烯烃类中具有柑橘果香的巴伦西亚橘烯质量浓度（4.72～6.93 mg/L）最高，真空冷冻固样组中未检出，其余4 组间无显著差异。液氮固样组的罗勒烯（0.17 mg/L）、α-法呢烯（4.90 mg/L）质量浓度均显著高于其余固样方式。真空冷冻固样组的月桂烯（0.12 mg/L）、大根香叶烯D质量浓度（0.92 mg/L）显著高于其他4 种固样方式。微波固样组的雪松烯（0.16 mg/L）显著高于热风固样浙商证券证交所，其他固样方式中未鉴定出。蒸汽固样组的(—)-Α-荜澄茄油烯（1.11 mg/L）、p-伞花烃质量浓度（0.30 mg/L）显著高于其他4 种固样方式。
酮类中的茉莉酮具有优雅的茉莉花香，但只在液氮固样组（0.98 mg/L）中检测到。蒸汽固样组的植酮质量浓度（0.07 mg/L）显著高于微波固样组（0.01 mg/L），其他3 种固样方式中未检测出。其他类中质量浓度最高的吲哚（0.54～1.54 mg/L）具有柑橘花、茉莉花香气，液氮固样组（1.50 mg/L）、真空冷冻固样组（1.45 mg/L）的吲哚质量浓度显著高于热风固样组（0.55 mg/L）、微波固样组（0.54 mg/L）和蒸汽固样组（1.54 mg/L）。
顺-2-戊烯醇（0.08 mg/L）、金合欢醇（0.52 mg/L）、顺-3-壬烯-1-醇（0.03 mg/L）、十一酸乙酯（6.32 mg/L）、2-甲基丁酸叶醇酯（0.07 mg/L）、2-己烯醛（2.19 mg/L）、(＋)-柠檬烯（0.05 mg/L）7 种挥发性物质仅在液氮固样组中检测出；庚醛（0.01 mg/L）、壬醛（0.06 mg/L）、茉莉酮（0.98 mg/L）仅在真空冷冻固样组中鉴定到；2-壬酮（0.85 mg/L）、甲基壬基甲酮（0.19 mg/L）仅在热风固样组中鉴定到。
液氮固样、真空冷冻固样组的挥发性物质总含量高，挥发性物质种类也较多。这是因为茶鲜叶在真空冷冻固样过程中，超低温和高真空条件使茶叶中水分由固态冰晶直接升华，茶叶中酶的活性被钝化，不能与茶叶中内含成分发生反应，最大程度上抑制茶鲜叶在物理、化学和生物学方面性质的改变，对生物组织和细胞体的损伤比较小，茶叶中的内源性香气挥发物被保留。蒸汽固样、热风固样和微波固样过程中发生的热物理化学变化较剧烈，鲜叶中的化学成分通过脱水、水解、取代、异构、氧化、还原等形式，使其在数量、组成比例、化学结构上发生变化。
03
不同固样处理茶叶的共有挥发性物质分析
5 种固样处理之间存在共有的挥发性物质，这些挥发性物质的变化规律能够反映不同固样处理对挥发性物质含量的影响。当样品处理较多时，Upset图可较好地展示处理间的交集。如图2A所示，真空冷冻固样组所含的挥发性成分数量最为丰富，而热风固样组最少。5 个固样处理组间的共有挥发性物质有16 个，分别是芳樟醇氧化物II、氧化芳樟醇III、橙花醇、橙花叔醇、红没药醇、T-依兰油醇、Α-毕橙茄醇、γ-己内酯、顺-3-己烯基丁酯、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯、反式-2-癸醛、癸醛、(—)-Α-荜澄茄油烯、p-伞花烃、1,2,3-三甲基苯、吲哚。各组共有挥发性物质总含量大小顺序为真空冷冻固样＞液氮固样＞蒸汽固样＞热风固样＞微波固样（图2C）。液氮固样与真空冷冻固样组的挥发性物质交集数量最高（13 个），表明在5 个处理组间它们的相似度最高。
如图2B所示，6 种共有挥发性物质（γ-己内酯、氧化芳樟醇III、癸醛、1,2,3-三甲基苯、(—)-A-荜澄茄油烯、p-伞花烃）在蒸汽固样组中含量最高，4 种（橙花醇、T-依兰油醇、红没药醇、A-毕橙茄醇）在液氮固样组中含量最高，6 种（反式-2-癸醛、橙花叔醇、芳樟醇氧化物II、顺-3-己烯基丁酯、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯、吲哚）在真空冷冻固样组中含量最高，热风固样和微波固样组中没有特别突出的挥发性物质。真空冷冻固样组的红色区域最为丰富，含量最多，它能够保留较多含量的共有挥发性物质，这些物质的保留与真空冷冻干燥过程中低温、低压环境有关，有效保护了热敏性挥发性成分，减少了氧化反应导致的香气成分损失。其次，通过升华作用去除水分，避免了液态水导致的水解，更好地保留了挥发性成分。此外，真空冷冻干燥能使其形成多孔结构，有助于后续香气提取，维持细胞完整性，减少酶与底物的接触，保护了香气前体物质。液氮固样组的红色部分比真空冷冻固样组少。而微波固样保留的共有香气物质含量最少，这可能与微波处理的快速加热特性有关，既不利于新香气物质的生成，也难以保留热敏性成分。
04
不同固样方式茶叶挥发性物质的多元统计分析
为分析5 种固样方式中‘黔茶1号’挥发性物质成分的差异，对其进行PCA和OPLS-DA。如图3A所示，5 种固样处理组的挥发性物质成分呈现不同的分布区域特性，热风固样、微波固样组明显聚集，表明这2 种固样方式相似程度很高。蒸汽固样与液氮固样组都有着较好的聚集。虽然真空冷冻固样组中D2有些偏离组内样本，但都在同一区域内，与其他处理间有着明显不同的分布区域。
不同固样方式‘黔茶1号’的挥发性物质成分出现明显差别，可进一步对其进行带有监督模式的OPLS-DA（图3B）。OPLS-DA中自变量拟合指数（Rx2）为0.970，因变量拟合指数（Ry2）为0.981，模型预测指数（ Q 2 ）为0.924， R 2 和 Q 2 均超过0.5表示模型拟合结果可以接受。与无监督的PCA得分图相比，5 组间有了最大程度的分离，且降低了样品的组内差异，这样便于更准确地寻找其差异挥发性物质。经过200 次置换检验， Q 2 回归线与纵轴截距小于零（图3C），说明模型不存在过拟合，模型验证有效，可用于5 组挥发性物质成分的判别分析。变量投影重要性（VIP）可以反映挥发性物质成分对模型分类的贡献程度，以VIP＞1为标准筛选差异挥发性物质。由图3D可知，有25 个挥发性物质成分的VIP＞1，说明这25 个挥发性物质是造成不同固样方式之间出现差异的标志性成分，这25 个差异挥发性物质包括雪松烯、2-壬酮、甲基壬基甲酮、 β -石竹烯、 α -法呢烯、月桂醇、 D -泛内酯、均三甲苯、反式-橙花叔醇、 γ -辛内酯、丙酸叶醇酯、2-乙基丁酸、反-2-十一烯醛、1-苯丙醇、植酮、丙位壬内酯、1,2,4-三甲基苯、氧化芳樟醇III、2-甲基丁酸叶醇酯、十一酸乙酯、雪松醇、金合欢醇、大根香叶烯D、凤梨醛、仲丁基苯。
结论
本研究采用液氮固样、真空冷冻固样、蒸汽固样、热风固样和微波固样5 种方式对‘黔茶1号’鲜叶进行固样，探究对其挥发性物质的影响。通过HS-SPME-GCMS技术分析共鉴定出73 种挥发性化合物，其中真空冷冻固样组的挥发性物质种类最多（48 种），总质量浓度最高（112.93 mg/L）；液氮固样组次之，鉴定出47 种挥发性物质，总质量浓度为94.81 mg/L；蒸汽固样和微波固样组均鉴定出38 种，总质量浓度分别为31.21 mg/L和29.60 mg/L；热风固样组的挥发性物质种类最少（37 种），总质量浓度最低（29.42 mg/L）。73 种挥发性化合物包括醇类、酯类、醛类、烯烃类、酮类、其他类，醇类最为丰富。冷处理的固样方式（真空冷冻固样和液氮固样）中醇类含量显著高于有热力参与的处理方式（蒸汽固样、微波固样和热风固样）。值得注意的是，液氮固样处理能够有效抑制样品中的酶活性，但在后续挥发性物质萃取过程中温度升高，部分酶可能重新活化，导致挥发性物质成分发生变化。这可能是液氮固样组的醇类含量低于同为冷处理——真空冷冻固样的重要原因。6 类挥发性物质中液氮固样能够更好地保留茶叶中的酯类、醛类和烯烃类物质，而真空冷冻固样则在醇类的保留上表现突出，蒸汽固样能够保留更多含量的其他类挥发性物质，微波固样中烯烃类物质较多，固样效果最差的为热风固样。相比之下，热风固样、微波固样和蒸汽固样3 种热固样方式在挥发性物质的保留上效果普遍较差，其中蒸汽固样在这3 种热固样方式中能够保留更多的酯类、醛类和其他类挥发性物质。在5 种固样处理组间有16 种共有挥发性物质，5 组共有挥发性总含量大小顺序为真空冷冻固样＞液氮固样＞蒸汽固样＞热风固样＞微波固样，表明样品中共有挥发性物质在真空冷冻固样方式下保留得更好。液氮固样与真空冷冻固样组中的挥发性物质交集数最高，这2 种固样方式的相似度最高。多元统计分析表明，除热风固样和微波固样组的挥发性物质相似程度较高外，其余不同固样方式下挥发性物质具有较大差异。同时，基于不同固样方式样本的有效区分，筛选出了25 种标志性差异挥发性物质。综上，不同的固样处理方法对挥发性物质的含量和组成有着重要影响。真空冷冻固样能够更大程度固定茶鲜叶中的挥发性物质，其次是液氮固样，效果最差的为热风固样。本研究对于选择合适的固样处理方法以及研究茶叶挥发性物质成分和特性具有现实意义，也可为‘黔茶1号’茶叶挥发性物质鉴定和分析提供实践参考。
作者简介
通信作者：
张小琴 贵州省农业科学院茶叶研究所副研究员，国家一级评茶师，国家二级茶艺技师，主要从事茶树栽培育种研究及茶叶技术推广工作。作为副主编撰写专著1 部，参加选育的茶树品种“贵定鸟王种”经贵州省品种审定委员会审定通过（排名第二）；获贵州省科学技术进步奖三等奖2 项、贵州省科技成果转化项二等奖1 项、地(厅)科学技术奖4 项；主持贵州省农业攻关项目2 项、贵州省成果转化项目1 项、贵州省动植物育种专项1 项、贵州省农科院专项资金项目1 项，参加国家茶产业技术体系遵义试验站项目、贵州省“百千万”科技特派员系统工程子项目、贵州省星火计划项目和贵州省农业科技攻关等项目10余项；发表文章12 篇，其中第一作者中文核心期刊4 篇。
第一作者：
杨显凤 ，贵州大学茶学院硕士研究生。2021-2024年就读于贵州大学茶学院，农业与种业专业，主要研究方向为茶树栽培。
本文《不同固样方式对‘黔茶1号’鲜叶挥发性物质的影响》来源于《食品科学》2025年46卷第14期216-224页，作者：杨显凤，张 拓，庞德文，席亚楠，曾廷廷，王 静，张小琴。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20241224-207。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：南伊；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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